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    IND級別細胞制劑工藝開發和生產

    3. 細胞制劑工藝開發

    本階段的目標是開發適合客戶細胞制劑的工藝。以細胞密度、活率、記憶型CAR-T、CAR拷貝數、PH值、滲透壓、殺傷效率、細胞因子釋放等檢測結果用來評估優化的結果。


    3.1 T分選磁珠選擇及比例研究

    確定篩選T細胞分選磁珠,及研究分選磁珠比例,根據分選效率、細胞表型以及增殖曲線進行評估。

    1.1.1使用單采血或者外周血通過密度梯度離心分離得到PBMC,PBMC分離前后會進行細胞密度、活率及記憶型CAR-T的測定,用來評估該步驟的細胞回收率以及對活率的影響。

    1.1.2分離后的PBMC,進行不同磁珠及不同磁珠比例用量比例、孵育條件的分選研究,分選后的細胞進行細胞密度、活率、細胞表型檢測,評估分選的回收率和純度。

    1.1.3本研究進行三批次不同供者進行測試對比,優化磁珠分選參數,為開展下一步工藝開發鎖定參數。

    本步驟需要客戶告知初始單采血的體積、細胞數量或者外周血體積。


    3.2 T細胞激活方式研究

    3.2.1用客戶指定的方式進行激活,研究激活成分的用量及激活時間,在不同激活時間后進行慢病毒轉導,轉導后進行繼續培養4天后測定細胞密度、活率和記憶型CAR-T。

    3.2.2本研究進行三批次不同供者進行測試對比,優化T細胞激活方式及激活時間,為開展下一步工藝開發鎖定參數。

    本步驟需要客戶告知激活方式。


    3.3 優化T細胞接種和培養密度

    3.3.1研究T細胞不同的接種密度和各階段不同的培養密度,根據細胞增殖曲線、細胞活率及細胞記憶型CAR-T進行評估。

    3.3.2本研究進行三批次不同供者進行測試對比。


    3.4 培養基篩選

    3.4.1對比不同商品化培養基、不同商品化營養添加成分、不同細胞因子釋放組成的不同完全培養基對激活后T細胞體外擴增及細胞記憶型CAR-T的影響。用不同完全培養基培養激活的T細胞,培養過程中每兩天取樣檢測細胞密度、活率,繪制增殖曲線。D5及收獲當天檢測記憶型CAR-T。

    3.4.2本研究進行三批次不同供者進行測試對比。


    3.5 優化病毒轉導方式

    3.5.1使用新鮮的PBMC和上述步驟確定的工藝和完全培養基,在確定的T細胞激活時間后測試不同的轉導方式,轉導后每2天檢測細胞密度和活率,轉導4天后,取樣檢測細胞密度、活率、轉導效率、CAR拷貝數。

    3.5.1本研究進行三批次不同供者進行測試對比。


    3.6 不同MOI條件下轉導效率對比測試

    3.6.1使用新鮮的PBMC和上述步驟確定的工藝,在轉導時MOI選擇6個梯度,轉導后每2天檢測細胞密度和活率,轉導4天后,取樣檢測細胞密度、活率、轉導效率、CAR拷貝數。

    3.5.1本研究進行三批次不同供者進行測試對比。


    3.7 凍存密度研究

    3.7.1使用新鮮的PBMC和上述步驟確定的工藝,進行三次完整的細胞生產,在收獲當天,對細胞原液進行收獲、清洗后,用遠泰自主的細胞冷凍保護劑PCP001對細胞進行重懸,配制成不同凍存密度的半成品,并進行細胞密度、活率、記憶型CAR-T、CAR拷貝數、PH值、滲透壓、殺傷效率、細胞因子釋放的檢測;然后進行包裝、程序降溫;程序降溫后的成品再采用客戶指定方式復蘇進行細胞密度、活率、記憶型CAR-T、PH值、滲透壓、殺傷效率、細胞因子釋放的檢測。

    3.7.2本研究采用三批次不同供者進行測試對比,同一供者同一密度平行凍存三份。


    3.8 細胞全長工藝確認

    3.8.1使用新鮮的PBMC和上述步驟確定的工藝,進行三次完整的細胞生產,并進行細胞密度、活率、記憶型CAR-T、CAR拷貝數、PH值、滲透壓、殺傷效率、細胞因子釋放的檢測。

    3.8.2本研究采用三批次細胞生產進行測試對比。


    3.9 單采血/外周血穩定性

    3.9.1使用上述所有步驟確定的工藝,進行三個供者單采血和單個供者外周血不同方式不同供者的采集,進行每種采血方式三個制備時間點的十八批次完整的細胞生產,并進行細胞密度、活率、記憶型CAR-T、CAR拷貝數、PH值、滲透壓、殺傷效率、細胞因子釋放的檢測對比,研究單采血/外周血穩定性。

     


    預計可交付結果

    細胞制劑工藝開發方案和報告;

     


    3.10 細胞分析方法開發、確認和驗證

    遠泰生物擁有具備細胞制劑分析檢測的開發能力,并已建立以下細胞制劑的檢測方法,可根據客戶的實際需要對分析方法進行驗證。


    檢測項目

    方法

    外觀

    目視法

    PH

    電位法

    滲透壓

    冰點下降法

    細胞計數

    熒光細胞計數法、臺盼藍染色計數、流式細胞術等

    無菌檢測

    直接培養法、薄膜過濾法、Bact/Alert無菌快檢法等

    內毒素檢測

    動態顯色法、凝膠法

    支原體檢測

    熒光PCR、培養法、DNA染色法

    記憶型CAR-T/其他細胞表型檢測

    流式細胞法

    CAR拷貝數檢測

    PCR法

    殺傷活性檢測

    RTCA法、LDH釋放、Calcein-AM、細胞計數、流式法等

    細胞生物學活性機制評價

    細胞因子釋放法

    RCL

    PCR法

     

     

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